События Assassin’s Creed: Brotherhood разворачиваются непосредственно после финала Assassin’s Creed 2. Ученые продолжают сканировать генетическую память Дезмонда Майлза, изучая дальнейшую историю жизни его предка Эцио Аудиторе Флорентийского. В новой игре знакомый поклонникам юноша предстает взрослым мужчиной около сорока пяти лет и является одним из лидеров и наставников ордена ассасинов. Вместе со своими соратниками он отправляется в Рим - в город, который находится под безраздельным влиянием испанского дворянского рода Борджиа. Против этого клана, его коррумпированных приспешников и членов ордена Тамплиеров Эцио предстоит вести борьбу.